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植物原生質(zhì)體分離用到的那些酶
植物原生質(zhì)體分離原理

植物原生質(zhì)體是除去細胞壁后為原生質(zhì)所包圍的“裸露細胞”,是開展基礎(chǔ)研究的理想材料,在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應用前景。

酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù),其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成,因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分,除去細胞壁,即可得到原生質(zhì)體。

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植物原生質(zhì)體分離方法

植物原生質(zhì)體分離的方法分為機械分離法和酶解分離法。

機械分離法:先將細胞放在高滲糖溶液中預處理,待細胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離,原生質(zhì)體收縮成球形后,再用機械法磨碎組織,從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。

用機械法分離細胞的明顯優(yōu)點是細胞不會受到酶的傷害,有利于開展生理生化研究。一般只用于薄壁組織排列松散、細胞間接觸點很少的葉肉細胞,產(chǎn)量低,不易獲得大量活性細胞。

酶解分離法:指將材料放入能降解細胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間,在酶液的作用下,細胞壁被降解,從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。

常用的酶種類:纖維素酶類(纖維素酶cellulase、半纖維素酶hemicellulase、崩潰酶driselase)、果膠酶類(果膠酶pectinase和離析酶macerozyme)、蝸牛酶snailase、胼胝質(zhì)酶callosease等。

草本植物體細胞分離原生質(zhì)體

利用纖維素酶類和果膠酶類中的2-3種酶組合成的混合酶液即可達到原生質(zhì)體分離的目的,纖維素酶濃度一般為0.5%-3%,果膠酶濃度為0.1%-1%(見下表)。

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木本植物體細胞分離原生質(zhì)體

由于細胞壁的構(gòu)成與草本植物有所不同,因此其混合酶液的組成和濃度與草本植物有差異。分解木本植物細胞壁,纖維素酶是不可缺少的,其濃度范圍與草本植物相同,但果膠酶的使用比草本植物更普遍(見下表)。

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由于原生質(zhì)體內(nèi)部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,還應當考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質(zhì)體的影響。

從理論上講,植物體的任何一部分都可以通過酶解作用去除細胞壁而得到原生質(zhì)體。但在實際操作中,只有幼嫩的組織才能完成去壁的過程。所以,為了制備健康的原生質(zhì)體,一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對數(shù)生長期的愈傷組織為材料,一旦細胞具有木質(zhì)化或次生加厚的外壁,則不能被酶降解。


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